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Germinación in vitro

Tema en 'Semilleros, injertos y esquejes de cactus' comenzado por valpit, 7/9/15.

  1. valpit

    valpit

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    Saludos compañeros foreros.

    Pues si como el tema lo indica, alguien que haya intentado la germinación in vitro?
    verán desde hará unos 4 años lo vi por primera vez e intenté realizarlo pero por no tener instalaciones ni material adecuado no lo había conseguido hasta hace unos meses.

    No se si sea de su interés el tema pero en fin. Me gustaría compartirles las fotos de lo que he logrado.

    Primero que nada les explicare de que se trata ésto para quienes no estén familiarizados. La germinación in vitro como su nombre lo indica es germinar semillas en un ambiente cerrado, libre de contaminantes. Bastante parecido a lo que hacemos para germinar nuestras semillas no? solo que se germinan en medios sintéticos, no en tierra. Aquí la primer pregunta válida ¿y para qué hacerlo en un medio sintético? bueno, pues si se tratara de investigación es más que nada para ver como se desarrolla la planta sin las variables que no podamos controlar como la composición del suelo, así la germinamos en un medio donde conocemos las concentraciones de sus nutrientes. ¿Algún otro fin? Por supuesto, la micropropagación, que es mas que nada tomar una parte de la planta para obtener brotes de ésta y generar clones de la planta (como cuando uno de nuestros cactus arroja hijuelos) y así reproducir rápidamente un fragmento de la planta madre y obtener muchos clones.

    Les muestro lo que son los medios de cultivo. Existen infinidad de recetas para hacer medios caseros, sobre todo para orquideas he visto muchos. Yo utilizo el medio empleado en laboratorios: Murashige y Skoog (M&S) que es una mezcla de sales y hormonas ya probadas desde hace décadas, adicionadas de un medio gelificante (para que no quede líquido) que es el agar.

    [​IMG]
    Es un vaso estéril con medio M&S enriquecido con sucrosa y agar.

    Prácticamente cualquier semilla puede germinarse in vitro. Yo utilicé unas mammillarias, una especie de melocactus y unas de astrophytum que me regalaron. Aquí la clave es desinfectar y esterilizar las semillas, pues están llenas de hongos y bacterias, las cuales crecen mucho más rápido que nuestra planta, derivando en una contaminación y putrefacción de la semilla.

    La semilla se inocula en un ambiente limpio, de preferencia en flujo laminar, para evitar contaminaciones del aire. Simplemente cerramos nuestro recipiente y a diferencia de nuestros germinadores convencionales NO se abren para nada.

    Les muestro los resultados.

    [​IMG]
    2 Astrophytum que germinaron y 3 semillas sin germinar. Incluso de éstas la mitad las sembre convencionalmente en tierra y solo una me germinó :s


    Estas fueron sembradas el 11/Agosto/2015 Melocactus curvispinus
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    [​IMG]


    Sembradas en la misma fecha, estas son Mamillarias sp.
    [​IMG]
    [​IMG]


    Estas son las más viejas, son Mamillarias también, no recuerdo exactamente la fecha en que sembré pero debió ser por marzo o abril. Pueden observar las raíces y unas pequeñas espinas brotando.
    [​IMG]


    Estas fueron mis primeros intentos, no recuerdo fechas, la verdad esta primer composición de medio de cultivo no fué muy provechosa.
    [​IMG]
    [​IMG]



    Si alguien le interesa o quiere compartir sus experiencias se los agradezco.
  2. valpit

    valpit

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    Ahora que lo recuerdo las semillas de la 6 fotografía son G. ragoneseii, las sembre a finales de mayo.

    Su contraparte en el método tradicional:
    [​IMG]

    [​IMG]


    Desde luego sigo prefiriendo hacerlo en tierra, es mucho mas económico, sencillo y te ahorras andar buscando materiales y equipos especiales, pero que más da, siempre quise hacer los in vitro y se me dió la oportunidad de hacerlo en un laboratorio
  3. laiguanapatagonica

    laiguanapatagonica

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    Muy interesante Valpit, gracias por compartir tu experiencia :okey: y el relevamiento fotográfico.
    Más que nada como estrategia de conservación y reintroducción de plantas enfocadas en preservar la diversidad genética de las especies .:Geek:
    Argentina presenta unas 235 especies de cactus (Zuloaga et al. 2008), siendo uno de los países con mayor riqueza, México esta primero claro:Inlove: y una proporción de especies endémicas del 61% (Ortega-Baes & Godínez-Alvarez 2006).
    Donde vivo, nada más tengo acceso a los métodos tradicionales :Redface:. Pero me comunicaré con colegas y capaz estén interesados en compartir materiales, métodos, rangos de germinación, porcentajes de dormancia , etc .
    Muchas gracias y ojalá otro aporte como el tuyo aparezca por aquí.
    :abrazar::okey:
    mari6 y valpit dan las Gracias.
  4. PINCHUDO

    PINCHUDO ARIEL

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    muy interesante sobretodo para especies que no se nos dan bien o nos resultan dificiles, como funcionara los lithops que a muchos le son dificiles de mantener en semilero no?

    saludos
    laiguanapatagonica y valpit dan las Gracias.
  5. miguel rodriguez

    miguel rodriguez me encantan los cactus!!!

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    gracias! es superinteresante!!!
    valpit da las Gracias.
  6. valpit

    valpit

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    No había pensado en litops, no se que tan viable sea, pues hay una alta humedad debido al medio de cultivo, la verdad la germinación yo considero lo de menos, lo difícil es la transición de in vitro a ex vitro, adaptarlos a un ambiente húmedo y reducir gradualmente la humedad.

    La verdad como les comento fué meramente por curiosidad hacerlo, aquí en el departamento de investigaciones biológicas de la Universidad lo hacen, pero sus líneas de investigación son solo en ciertas especies. El orquideario de la ciudad igual hacen éste tipo de propagación pero orquídeas solamente.
    No se quien lo haga en cactaceas por aquí pero sería interesante seguir hasta lograr tenerlas en sustrato adecuado.

    Lo que si se podría hacer es tomar la pequeña plántula y buscar un micro injerto, que es el próximo paso que pretendo, ya tengo los pereskiopsis enraizando, solo esperar que crezcan un poco más e injertarlas. Si todo sale bien el plan es comenzar con especies de dificil crecimiento o muy escasas
  7. antnio

    antnio

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    laiguanapatagonica da las Gracias.
  8. valpit

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    Que tal Antonio. Mira la composición como tal son más de 15 sales, yo compro el medio liofilizado (es decir en polvo) solo para disolver en agua. Se llama Murashige & Skoog, al menos en mi país lo tuve que pedir de la Sigma-Aldrich, no es fácil de conseguir este medio. Te venden un sobre para preparar 1 L pero como es bastante se hacen cálculos para preparar lo que uno guste, en mi caso hago lotes de 100ml. Se le agrega agar para que solidifique en una proporción del 9% y por último Dextrosa al 20%. Todo eso se disuelve en agua destilada de preferencia, se lleva a los recipientes que quieras utilizar y se mete todo al autoclave para esterilizar.

    Ésta es la forma como se trabaja en los laboratorios de biotecnología, la verdad composiciones caseras desconozco. Hay un hilo en la sección de orquideas donde dan varias recetas caseras.
    mari6 da las Gracias.
  9. mari6

    mari6 María

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    Lo había visto en cultivo de carnívoras, y me planteaba si sería factible hacerlo en suculentas y cactáceas. Me alegra ver que te ha ido tan bien en el experimento, y me alegra más aún que hayas compartido tus resultados en el foro :-) muchas gracias!

    Si decides seguir experimentando con otros géneros, tienes todo mi apoyo y ánimos :okey:
    valpit y laiguanapatagonica dan las Gracias.
  10. valpit

    valpit

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    Gracias mari6, en realidad he experimentado de todo un poco. Comencé con cactus porque como sabrás son mi mayor afición y tengo mayor acceso a semillas de mis propias plantas.

    Lo intenté con carnivoras pero solo conseguí unas cuantas semillas de Byblis pero gasté la mayoría en ver si eran viables al ponerlas en sustrato y la germinación in vitro no fue bien porque también estaba estandarizando la composición del medio.

    En cuanto a orquídeas no he podido conseguir semillas tampoco, solicite en el foro de orquídeas quien me vendiera pero al parecer no ha habido respuesta jeje, en fin la verdad me interesa más las cactaceas; las suculentas no lo he intentado, trataré de conseguir semillas ;-) y ya que tenga bien dominado esto de la germinación comenzaré con la propagación a partir de esquejes
  11. manuelantonio

    manuelantonio

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    interesante tu experiencia. podrías explicar con mas detalle el método de preparación del medio, que tiempo esperas para que se pueda sacra el cactus al medio externo, cual es la relación de mezcla de sucrosa y agar, y que volumen se puede usar para vertir en tubos de ensayo o en los envases que muestras? con que descontaminas las semillas y el tiempo para ello. gracias. las de melos estan increibles.
  12. valpit

    valpit

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    Que tal manuelantonio, claro con mucho gusto, en realidad no puse toda esos datos para no saturar de información. Les explico un poco.

    Preparación del medio.

    Utilizo el medio de cultivo llamado Murashige & Skoog basal salt (de Sigma Aldrich) es un polvo para preparar 1 Litro de medio de cultivo, pero como son solo sales, hay que adicionar agar para que quede con ese aspecto semisólido de gelatina.

    Esta es la formulación original de Murashige & Skoog
    Macronutrientes
    NH4NO3 16.5g/L
    KNO3 19g/L
    CaCl2 4.4g/L
    MgSO4 3.7g/L
    KH2PO4 1.7g/L

    Micronutrientes
    MnSO4 1.69g/L
    ZnSO4 0.86g/L
    H3BO3 0.62g/L
    KI 83mg/L
    Na2MoO4 25mg/L
    CuSO4 2.5mg/L
    CoCl2 2.5mg/L
    FeSO4 5.5 mg/L

    Como se me hace un desperdicio preparar un litro del medio porque utilizo muy poco por ahora, entonces hago cálculos dependiendo de lo que quiera preparar. La presentación es de 4.4g para 1 L; si quiero preparar 100mL debo utilizar 1/10 parte del medio, es decir 0.44g.
    Peso en una balanza granataria y lo transfiero a un vaso de precipitados porque es muy higroscópico (se humedece en cosa de nada). Le adiciono los 100mL de agua destilada, agito y caliento (Para esto hay unos agitadores magnéticos que tienen parrilla para calentar).

    Una vez disueltas las sales es hora de agregar la sucralosa. Algunas de las recetas que vi dicen que al 3%, varía dependiendo de dónde se investigue. Si preparamos 100ml agregaríamos 3g de sucralosa.
    Una vez disuelto se agrega el agar en una concentración del 0.7% es decir que por cada 100 ml de agua hay que agregar 0.7 g de agar.

    Se sigue agitando y debe estar caliente para que el agar y la sucralosa se disuelvan adecuadamente. Ahora hay que ajustar el pH del medio a las condiciones que uno lo requiera, algunas plantas requieren más acidez que otras. Lo que investigue de varios trabajos con cáctaceas es que se usaba un pH ácido, así que ajuste a 5.6 Si no mal recuerdo queda con un pH como de 6 cuando se prepara, así que lo acidifique un poco.

    Es importante que se siga agitando porque si se deja de hacer se sedimenta el agar y va a pasar que al vaciar en los recipientes los primeros no solidificarán porque el agar quedó en el fondo, así que de preferencia manteniendo una temp. de unos 50º y agitando entre cada vaciada los vertemos en los recipientes que queramos utilizar.

    En las fotografías que muestro puse algunos tubos reciclados del laboratorio. De preferencia utilizar vidrio, como frascos guerber o de bebidas, bien lavados y secos antes de vaciarlo. Adicionamos el medio de cultivo, yo lo vierto como a 1/5 de la altura, será cuestión de que tanta raíz pueda hechar la semilla.
    Ahora que si lo queremos vertir en cajas petri (las que se usan para microbiología) éstas no soportan el autoclave, así que el medio se deja en un recipiente de vidrio con tapa (puede ser aluminio).

    Tomamos todos los recipientes ya con el medio de cultivo y los esterilizamos en el autoclave. 15 minutos a 121ºC con 1 atm de presión (15 psi). Una vez que termine el autoclave con cuidado sacamos los recipientes. El medio estará nuevamente líquido, hay que dejarlo que solidifique.

    A partir de aquí todo lo que está dentro del frasco está estéril. si lo abrimos se contaminará, así que solo se abrirá al momento de poner las semillas.
    antnio da las Gracias.
  13. valpit

    valpit

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    Desinfección de semillas.

    Es importante hacer una desinfección de las semillas pues a pesar de que al estar dentro del fruto se considera relativamente ésteril, una vez que las sacamos y manipulamos se contaminan. Nuestro medio de cultivo al tener una alta humedad y nutrientes, las bacterias y hongos son el principal problema, pues al desarrollarse más rápido que la semilla, colonizan el medio y nuestra semilla (al igual que en un semillero normal)

    Hay diversos métodos, el que yo utilicé me funcionó bien para las mammillarias y los melo, pero a los Astrophytum les redujo viabilidad.

    Primero se enjuagan con agua y detergente o jabón unos 20 minutos. Se enjuaga repetidas veces para quitar el exceso de detergente.

    Aquí comienza la parte de desinfectar. Se utiliza alcohol etílico al 70% (el de curación) sumergiéndolas unos 30 segundos. Cuidado de no exponerlas mucho tiempo porque las semillas dependen de las grasas que poseen para poder germinar, mucho tiempo en alcohol podría disolver parte de las grasas y restar viabilidad (como mis Astrophytum). A partir de aquí yo trabaje dentro de campana de flujo laminar. Si no se tiene se puede usar una CAI (campana de aire inmóvil) de fabricación casera. O bien, trabajamos en la llama de un mechero pero requiere más experiencia.
    Se enjuagan las semillas con agua estéril (conviene al momento de haber preparado el medio de cultivo poner a esterilizar agua) Otra solución es ir a la farmacia y comprar un bolo de agua inyectable (viene estéril). Ahora se ponen en lejía (cloro del que venden en las tiendas) al 5% es decir 5ml de cloro en 100 de agua por unos 2 minutos. Igual enjuagamos con agua estéril y ya están las semillas listas para ser sembradas.

    Seguimos trabajando dentro de un ambiente estéril, en mi caso dentro de la campana de flujo, se abren los recipientes con el medio de cultivo y vertimos las semillas. Cerramos y listo, a esperar que germinen nuestras semillas. Si notamos que empiezan a crecer como motitas de algodón o salen puntos de colores quiere decir que se contamino y habrá que desecharlo.

    La cuestión de pasar de in vitro a ex vitro ha de ser unos meses ya que la planta tenga un buen tamaño y raíces bien definidas. No he llegado a tal punto, lo que he leído es que se saca las plántulas, se les quita con un bisturí el exceso de agar y se lavan las raíces. Se ponen en el sustrato compuestro de perlita y se deja en una humedad del 100% pues era la humedad que tenían dentro de su frasco de cultivo. Se debe ir reduciendo gradualmente la humedad hasta adaptarlas al exterior.
  14. Cactusleon

    Cactusleon

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    Hola,
    Habré reproducido unas 250 especies de plantas por cultivo in vitro (entre ellas cactus y Lithops) y jamás vi que se utilizase sucralosa. Este edulcorante no es energético pues no es matabolizable. ¿No te referirás a sacarosa (el azúcar común)?
    Un saludo.
    mari6, antnio y valpit dan las Gracias.
  15. valpit

    valpit

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    Tienes razón Cactusleon, me equivoqué al escribir. Utilicé Sucrosa a-D-glucopiranosil b-D-fructofuranosa (es lo que tenía acá en el lab con lo que trabajaron antes) pero si, el primero lote lo hice con azucar común.